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    當前位置:首頁 > 科研服務 > 蛋白/核酸相互作用 > DNA-蛋白互作 > ChIP(染色質免疫共沉淀)
    實驗簡介買此服務常見問答

    ChIP(chromatin immunoprecipitation assay, 染色質免疫共沉淀)是研究體內DNA與蛋白結合的重要技術,主要包括ChIP-qPCR和ChIP-seq兩種;其中ChIP-qPCR用來驗證與目標蛋白結合的已知DNA片段,ChIP-seq用來篩選與目標蛋白結合的未知DNA片段。




    染色質免疫沉淀ChIP實驗原理


    先用甲醛交聯細胞內“蛋白-DNA”復合物,并用超聲波破碎DNA至適合的長度。細胞裂解后,孵育結合了抗體的珠子,誘餌蛋白通過其抗體便結合到了Beads上,同時和誘餌蛋白互作的DNA,也一起沉淀到Beads上。洗滌掉未結合的DNA后,再用洗脫液將DNA-蛋白復合物從Beads洗脫下來,便得到染色質免疫共沉淀產物。DNA-蛋白復合物去交聯后,既可qPCR檢測已知DNA片段,也可用二代測序與蛋白互作的DNA片段。


    當沒有合適的誘餌蛋白抗體時,可以通過表達融合了flag標簽的誘餌蛋白,利用flag標簽做免疫沉淀。即細胞過表達Flag-Bait,經裂解后與anti-Flag珠子孵育,誘餌融合蛋白與Beads結合,與誘餌融合蛋白互作的DNA“共沉淀”到Beads上,再經洗滌、洗脫后做qPCR或NGS測序。


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    染色質免疫沉淀ChIP實驗流程

    ChIP-qPCR實驗,染色質免疫共沉淀ChIP技術服務,DNA與蛋白互作外包平臺.jpg
    帶標簽的染色質免疫共沉淀流程圖:
    染色質免疫共沉淀ChIP實驗_代做染色質免疫共沉淀實驗_ChIP技術檢測.jpg




    應用領域


    coip技術服務.bmp






    ChIP技術應用背景


    ◆ 基因表達是一個復雜、調控有序的過程,DNA與蛋白質的相互作用是基因轉錄起始和調控的關鍵,研究它們的相互作用是研究染色質上基因表達調控的重要領域。


    chip(染色質免疫共沉淀)是檢測體內條件下DNA與蛋白質相互作用的方法,該技術由 Orlando等于1997年創立,目前已廣泛應用于組蛋白修飾、轉錄因子作用位點和DNA甲基化等研究中。


    轉錄因子也稱為反式作用因子,是指能夠與真核基因的順式作用元件發生特異性相互作用來激活或抑制基因表達的DNA結合蛋白。轉錄因子有4個主要結構域:DNA結合域決定了轉錄因子的特異性,轉錄調控域(包括激活域或抑制域)決定了轉錄因子的功能,寡聚化位點使不同轉錄因子間發生相互作用,核定位信號控制轉錄因子進入細胞核。


    組蛋白是染色質基本結構——核小體中的重要組成部分,其N-端尾部暴露在核小體的表面,可發生乙?;?、甲基化、磷酸化、泛素化、多聚 ADP 糖基化等共價修飾,影響組蛋白與DNA的親和性,改變染色質的疏松或凝集狀態,或影響其它轉錄因子與靶基因啟動子的親和性,激活或抑制基因表達。


    DNA甲基化是在不改變DNA序列的前提下,由DNA甲基轉移酶將S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基轉移到DNA上,其中發生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化(5-mC)是DNA甲基化的主要形式。甲基的引入使DNA分子空間結構改變,DNA大溝無法與DNA結合蛋白(轉錄因子、拓撲異構酶、RNA聚合酶、阻抑蛋白等)正常結合,導致某些基因轉錄失活。因此,DNA甲基化通常抑制基因表達,去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。





     


    ChIP實驗研究案例—客戶文章解析


    chip技術研究案例

    NCoR/SMRT與c-MYC共同抑制體細胞重編程




    研究背景

    研究者首先發現Ncor1(編碼NCoR)和Ncor2(編碼SMRT)在小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)、胚胎干細胞(ESC)和OSKM重編程細胞中均有表達。無論用怎樣的轉導方法、報告系統、MEF類型或培養基,抑制Ncor1/2的表達都能增強OSKM誘導的重編程。



    研究路線


    RNA-seq發現敲除NCoR/SMRT可在重編程后期激活多能性基因
    基因過表達/干擾結果顯示NCoR/SMART抑制重編程需要借助HDAC3去乙?;富钚?/span>
    H3K27ac的ChIP實驗表明HDAC3通過誘導多能基因位點的組蛋白去乙?;瘉硪种浦鼐幊?/span>
    NCoR/SMRT的ChIP實驗表明NCoR/SMRT通過HDAC3介導的組蛋白去乙?;种贫嗄芑蚣せ?/span>
    COIP和ChIP等表明c-MYC與 NCoR/SMRT和HDAC3相互組用,招募它們到多能基因位點
    報告基因和誘導重編程等實驗發現c-myc募集NCoR/SMRT-HDAC3抑制多能基因對重編程晚期是不利的




    研究結論

    本研究發現NCoR/SMRT–HDAC3共抑制復合物通過與OSKM因子(尤其是c-MYC)相互作用為重編程制造障礙,這一發現揭示了c-MYC在重編程中的雙重作用,也有助于解釋為何用OSKM而非OSK誘導重編程更容易產生pre-iPSCs,以及為何用HDAC抑制劑對OSKM而非OSK誘導的重編程能產生更強的效果等問題。



    客戶文獻

    Zhuang Q. et al: NCoR/SMRT co-repressors cooperate with c-MYC to create an epigenetic barrier to somatic cell reprogramming. Nature Cell Biology. 2018. (IF=28.824)




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    輝駿實力

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    輝駿生物提供的ChIP染色質免疫共沉淀服務分為以下兩種:


    1. ChIP qPCR,用于檢測某樣本中的誘餌蛋白和待測DNA片段是否結合;

    2. ChIP seq,用于篩選某樣本中的誘餌蛋白可以結合哪些DNA區域。


    ChIP(染色質免疫共沉淀)檢測服務
    服務項目
    服務內容結果交付實驗周期客戶提價格
    ChIP qPCR
    Western blot檢測樣本(input)中的誘餌蛋白Western blot檢測圖5-6周

    實驗樣本

    誘餌蛋白的IP級抗體

    實驗信息表(樣本信息,誘餌蛋白及待測DNA序列)



    點擊詢價



    ChIP調取誘餌蛋白及其結合的DNA片段

    (2組:實驗組和對照組)
    ChIP實驗報告
    Western blot檢測ChIP產物中的誘餌蛋白Western blot檢測圖
    qPCR檢測ChIP產物中的待測DNA片段
    qPCR檢測數據
    ChIP seqWestern blot檢測樣本(input)中的誘餌蛋白Western blot檢測圖5-6周

    實驗樣本

    誘餌蛋白的IP級抗體

    實驗信息表(樣本信息,誘餌蛋白序列)



    點擊詢價



    ChIP調取誘餌蛋白及其結合的DNA片段

    (2組:實驗組和對照組)
    ChIP實驗報告
    Western blot檢測ChIP產物中的誘餌蛋白Western blot檢測圖
    seq檢測ChIP產物中的DNA片段并分析
    seq檢測結果、檢測和分析報告9周


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    ChIP服務優勢*輝駿生物

    1

    近十年服務經驗,服務案例眾多,客戶發文Nature Cell Biology等高質量期刊

    2

    可對圍繞DNA結合蛋白開展的整體課題提供全方位方案建議

    3

    自有分子及細胞生物實驗平臺,能有效制定并執行最優的實驗路線

    4

    售后技術支持將一直保持到客戶發表文章,確??蛻舭残倪M行下游實驗及投稿



    染色質免疫共沉淀ChIP樣本要求


    1. 送樣量要求


    樣本類型ChIP-qPCR建議送樣量ChIP-seq建議送樣量
    動物細胞3*10e7個細胞/組(約3個10cm皿)5*10e7個細胞/組(約5個10cm皿)


    ▲注意:這里列出的均為每組樣本的送樣量,如果實驗和對照組用的樣本一致,此樣本量*2。詳細送樣指南可聯系輝駿生物客服或銷售索取。

     


    2. 樣本保存和運輸要求:

    (1)客戶收集細胞前需要先進行甲醛交聯,之后收集細胞沉淀,用PBS清洗干凈后,離心去掉液體,先放入液氮中速凍,再轉移至-80℃冰箱中保存;廣州市內的客戶也可以提供活細胞(常溫運輸,如果冬天溫度較低可以用37℃復溫的冰袋保存),我方交聯;

    (2)樣本一定要做好標記,應用油性防凍記號筆或標簽紙在管上注明樣本名稱或編號;

    (3)樣本較多或需要分批做,要將樣本分裝;

    (4)干冰取樣/運輸;需要至少在送樣前一天通知我方。

     




    Chip實驗結果示例


    圖片.png

    ChIP qPCR檢測數據



      ChIP組相對于input組的富集圖(% input)


    ChIP組相對于IgG組的富集圖

                



                                                                                       


    ChIP實驗客戶文章


    1.Zhuang Q. et al: NCoR/SMRT co-repressors cooperate with c-MYC to create an epigenetic barrier to somatic cell reprogramming. Nature Cell Biology.2018,IF=17.728.
    【研究內容】:客戶通過RNA-seq證明了NCoR/SMRT共抑制子與多能位點結合,IP實驗、ChIP-qPCR分析進一步表明,NCoR/SMRT-HDAC3復合物在OSKM重編程中誘導組蛋白去乙?;亩嗄芪稽c。ChIP-seq分析發現,NCoR/SMRT中還存在著一個c-MYC結合基序。研究揭示了NCoR/SMRT共抑制子在重編程中的作用,并提出了c-MYC在這一過程中的雙重功能。
    使用相關技術:染色質免疫共沉淀ChIP、chip qpcr實驗


    2.Wang R.H. et al: A requirement for breast-cancer-associated gene 1(BRCA1) in the spindle checkpoint. PANS. 2004,IF=9.58.
    【研究內容】:研究表明BRCA1缺陷型細胞的有絲分裂受到影響,存在紡錘體檢查點缺陷??蛻魴z測和紡錘體檢查點密切相關的幾個基因,發現BRCA1缺陷型Mad2基因表達水平變化明顯,由此推測BRCA1是通過影響Mad2的表達,從而影響有絲分裂的。DNA pulldown及ChIP-qPCR實驗證實了BRCA1可以和Mad2啟動子結合,進一步研究發現BRCA1確實上調Mad2從而影響有絲分裂。
    使用相關技術:chip技術服務、染色質免疫共沉淀ChIP-seq


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    Input原理及其作用是什么?

    DNA或者RNA片段化后,在進行免疫沉淀前,需要取一部分斷裂后的染色質做Input對照(不進行免疫沉淀過程)。Input是斷裂后的基因組DNA或者RNA,需要與沉淀后的樣品DNA/RNA一起經過逆轉交聯,DNA/RNA純化,以及最后的PCR或其他方法檢測。通過后續數據分析,我們可以通過Input對照排除背景噪音(排除因本底表達水平高或一些非特異性結合所造成的假陽性peaks),驗證染色質斷裂的效果和整個實驗中IP效果,所以Input對照是IP-seq實驗必不可少的步驟。


    哪些物種可以做ChIP-Seq?

    物種為2倍體,基因拼接至染色體水平(NCBI),注釋完整(GTF文件)即可。其他物種需要實驗,可咨詢輝駿生物技術熱線:400-699-1663


    Input和IP樣本之間的關系是什么?

    Input和IP屬于兩個樣本,在前期檢測、建庫、測序都是平行進行的,但是分析中需要將兩個樣本的測序數據進行整合分析,得出最終的peak結果,并進行后續分析。

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