ChIP（chromatin immunoprecipitation assay, 染色質免疫共沉淀）是研究體內DNA與蛋白結合的重要技術，主要包括ChIP-qPCR和ChIP-seq兩種；其中ChIP-qPCR用來驗證與目標蛋白結合的已知DNA片段，ChIP-seq用來篩選與目標蛋白結合的未知DNA片段。
染色質免疫沉淀ChIP實驗原理
先用甲醛交聯細胞內“蛋白-DNA”復合物，并用超聲波破碎DNA至適合的長度。細胞裂解后，孵育結合了抗體的珠子，誘餌蛋白通過其抗體便結合到了Beads上，同時和誘餌蛋白互作的DNA，也一起沉淀到Beads上。洗滌掉未結合的DNA后，再用洗脫液將DNA-蛋白復合物從Beads洗脫下來，便得到染色質免疫共沉淀產物。DNA-蛋白復合物去交聯后，既可qPCR檢測已知DNA片段，也可用二代測序與蛋白互作的DNA片段。
當沒有合適的誘餌蛋白抗體時，可以通過表達融合了flag標簽的誘餌蛋白，利用flag標簽做免疫沉淀。即細胞過表達Flag-Bait，經裂解后與anti-Flag珠子孵育，誘餌融合蛋白與Beads結合，與誘餌融合蛋白互作的DNA“共沉淀”到Beads上，再經洗滌、洗脫后做qPCR或NGS測序。
染色質免疫沉淀ChIP實驗流程
帶標簽的染色質免疫共沉淀流程圖：
應用領域
ChIP技術應用背景
◆ 基因表達是一個復雜、調控有序的過程，DNA與蛋白質的相互作用是基因轉錄起始和調控的關鍵，研究它們的相互作用是研究染色質上基因表達調控的重要領域。
◆ chip（染色質免疫共沉淀）是檢測體內條件下DNA與蛋白質相互作用的方法，該技術由 Orlando等于1997年創立，目前已廣泛應用于組蛋白修飾、轉錄因子作用位點和DNA甲基化等研究中。
◆ 轉錄因子也稱為反式作用因子，是指能夠與真核基因的順式作用元件發生特異性相互作用來激活或抑制基因表達的DNA結合蛋白。轉錄因子有4個主要結構域：DNA結合域決定了轉錄因子的特異性，轉錄調控域（包括激活域或抑制域）決定了轉錄因子的功能，寡聚化位點使不同轉錄因子間發生相互作用，核定位信號控制轉錄因子進入細胞核。
◆ 組蛋白是染色質基本結構——核小體中的重要組成部分，其N-端尾部暴露在核小體的表面，可發生乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化、多聚 ADP 糖基化等共價修飾，影響組蛋白與DNA的親和性，改變染色質的疏松或凝集狀態，或影響其它轉錄因子與靶基因啟動子的親和性，激活或抑制基因表達。
◆ DNA甲基化是在不改變DNA序列的前提下，由DNA甲基轉移酶將S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基轉移到DNA上，其中發生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化（5-mC）是DNA甲基化的主要形式。甲基的引入使DNA分子空間結構改變，DNA大溝無法與DNA結合蛋白（轉錄因子、拓撲異構酶、RNA聚合酶、阻抑蛋白等）正常結合，導致某些基因轉錄失活。因此，DNA甲基化通常抑制基因表達，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。
ChIP實驗研究案例—客戶文章解析
NCoR/SMRT與c-MYC共同抑制體細胞重編程
研究背景
研究者首先發現Ncor1(編碼NCoR)和Ncor2(編碼SMRT)在小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)、胚胎干細胞(ESC)和OSKM重編程細胞中均有表達。無論用怎樣的轉導方法、報告系統、MEF類型或培養基，抑制Ncor1/2的表達都能增強OSKM誘導的重編程。
研究路線
RNA-seq發現敲除NCoR/SMRT可在重編程后期激活多能性基因基因過表達/干擾結果顯示NCoR/SMART抑制重編程需要借助HDAC3去乙?；富钚?/span>H3K27ac的ChIP實驗表明HDAC3通過誘導多能基因位點的組蛋白去乙?；瘉硪种浦鼐幊?/span>NCoR/SMRT的ChIP實驗表明NCoR/SMRT通過HDAC3介導的組蛋白去乙?；种贫嗄芑蚣せ?/span>COIP和ChIP等表明c-MYC與 NCoR/SMRT和HDAC3相互組用，招募它們到多能基因位點報告基因和誘導重編程等實驗發現c-myc募集NCoR/SMRT-HDAC3抑制多能基因對重編程晚期是不利的
研究結論
本研究發現NCoR/SMRT–HDAC3共抑制復合物通過與OSKM因子（尤其是c-MYC）相互作用為重編程制造障礙，這一發現揭示了c-MYC在重編程中的雙重作用，也有助于解釋為何用OSKM而非OSK誘導重編程更容易產生pre-iPSCs，以及為何用HDAC抑制劑對OSKM而非OSK誘導的重編程能產生更強的效果等問題。
客戶文獻
Zhuang Q. et al: NCoR/SMRT co-repressors cooperate with c-MYC to create an epigenetic barrier to somatic cell reprogramming. Nature Cell Biology. 2018. (IF=28.824)
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