雙熒光素酶報告基因實驗原理

熒光素底物在熒光素酶作用下會發光，且光強度能反應熒光素酶的蛋白表達量。而熒光素酶的蛋白表達量，又和啟動子活性、mRNA的穩定性及翻譯效率等有關。利用這個特點，將待測啟動子、UTR等序列與熒光素酶ORF框融合表達，再檢測其發光強度，就能判斷這些序列對蛋白表達的影響。這就叫熒光素酶報告基因檢測。
為了減少實驗誤差，一般會同時轉染一個能穩定表達熒光素酶的質粒作為內參，所以叫雙熒光素酶報告基因檢測。

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雙熒光素酶報告基因實驗流程

圖一：啟動子活性分析示意圖

圖二：啟動子和轉錄因子互作分析示意圖

應用領域

雙熒光素酶技術實驗應用背景

雙熒光素酶報告基因分析通常以螢火蟲熒光素酶為報告基因，以海腎熒光素酶為內參基因。所構成的報告系統具有靈敏度高、動態范圍廣、應用靈活等優勢，廣泛應用于基因調控、非編碼RNA靶向互作等研究領域。

雙熒光素酶檢測啟動子活性研究案例—客戶文章解析

P300/YY1/miR-500A-5p/HDAC2信號軸調節結直腸癌癌細胞增殖

研究背景

結直腸癌(CRC)是全球癌癥相關性死亡的主要原因之一，復發率和轉移率較高。闡明CRC發生和轉移的機制將有助于尋找新的診斷生物標志物和開發有效的治療干預措施。在過去的研究中已經發現了一些參與結直腸癌形成和發展的蛋白質編碼基因，然而，包括microRNA(MiRNA)在內的非編碼RNA的功能在很大程度上仍需進一步研究。

研究路線

研究結論

本研究確定miR-500a-5p在結直腸癌組織中下調，miR-500a-5p水平受到YY1/p300/HDAC2轉錄復合體的協同調控。此外，miR-500a-5p還通過直接結合HDAC2的3’UTR來抑制結直腸癌細胞增殖和遷移。

客戶文獻

Tang W.W. et al: The p300/YY1/miR-500a-5p/HDAC2 signalling axis regulates cell proliferation in human colorectal cancer. Nature Communications. 2019, IF=12.121.

蛋白組/代謝組實驗

? iTRAQ 定量蛋白質組學

? Label Free 實驗檢測服務

? LC-MS/MS 蛋白質譜鑒定

? DIA 全息掃描定量蛋白質
? 廣泛靶向代謝組學

蛋白/核酸相互作用實驗

? GST pull down

? RNA pull down

? DNA pull down

? Co-IP 免疫共沉淀

? TAP-MS串聯親和純化

分子細胞生物學實驗

? 基因調取/合成 (cDNA克隆)

?熒光定量PCR (qPCR)

? 載體構建實驗服務

?miRNA靶基因驗證
? 慢病毒包裝

科研產品

? 哺乳動物細胞表達載體

? 人cDNA克隆庫

? 慢病毒表達載體

? 慢病毒干擾載體

抗體工程服務

? 單克隆抗體測序

? 抗體從頭測序

? 抗體表達服務

? 重組抗體表達

實驗試劑盒

? RNA pull down 試劑盒

? GST pull down 試劑盒

? COIP 試劑盒

? Flag 試劑盒

輝駿實力

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輝駿生物提供的雙熒光素酶報告檢測啟動子活性服務主要分為以下兩種：

1. 啟動子活性分析，用于檢測待測啟動子是否有活性及其活性區域；

2. 啟動子與轉錄因子結合驗證，用于研究某轉錄因子是否調控某基因的待測啟動子，以及它們的結合區域。

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雙熒光素酶報告基因實驗*輝駿生物優勢

Luc（雙熒光素酶報告基因）技術服務樣本要求

1. 送樣要求

2. 樣本保存和運輸要求：

（1）質?；蚋视途捎帽４孢\輸；

（2）活細胞常溫取樣；

（3）凍存細胞干冰取樣/運輸：需要至少在送樣前一天通知我方。

雙熒光素酶檢測啟動子活性結果示例

雙熒光素酶報告基因檢測圖

雙熒光素酶檢測啟動子活性客戶文章

1. Chen R. et al: Lnc-GD2H Promotes Proliferation by Forming a Feedback Loop With c-Myc and Enhances Differentiation Through Interacting With NACA to Upregulate Myog in C2C12 Myoblasts. Front Cell Dev Biol. 2021, IF=6.684. 【研究內容】：本研究采用熒光素酶報告分析、pull down、ChIP、RIP等方法，研究了新型非編碼RNA(LncRNA)lnc-GD2H在促進C2C12成肌細胞增殖分化和肌肉再生中的作用。結果表明，在成肌細胞增殖和分化過程中，lnc-GD2H的表達增強，且在成肌細胞增殖過程中，lnc-GD2H促進了增殖標記基因的表達，并與c-Myc形成反饋環。在成肌細胞分化過程中，lnc-GD2H與NACA相互作用，減輕NACA對Myog的抑制作用，從而促進Myog的表達，促進分化。這些結果有助于理解lncRNAs調控成肌細胞增殖和分化的機制。 使用相關技術: 啟動子與轉錄因子結合驗證，轉錄因子驗證，雙熒光素酶如何檢測

2. Zhu J.Y. et al: Aryl Hydrocarbon Receptor Promotes IL-10 Expression in Inflammatory Macrophages Through Src-STAT3 Signaling Pathway. Frontiers in Immunology. 2018 , IF=4.716. 【研究內容】：本研究首次大規模鑒定了家蠶絲腺中與絲素基因啟動子區域相互作用的蛋白質，包括絲素重鏈(Fibre H)、絲素輕鏈(FiBL)和一個25kD的多肽蛋白(P25)。通過DNA pull down結合質譜分析，從后絲腺中分別鑒定出198、292和247個或330、305和460個與FibH、FiBL和P25啟動子區域相互作用的蛋白質。此外，在M4和L5D5中分別鑒定出135個和212個蛋白是FibH、FiBL和P25的共同互作蛋白。其中鑒定出31個潛在的轉錄因子，如Y-box和PolyA結合蛋白，它們在核苷酸結合、ATP結合或蛋白質折疊中發揮作用。 使用相關技術: Luc技術服務，啟動子活性分析檢測

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