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    實驗簡介買此服務買試劑盒
    GST pull down實驗原理


    GST pull down是將GST融合蛋白作為探針固化到凝膠柱上,與溶液中的目的蛋白相結合??捎脕泶_定融合(或探針)蛋白與未知(或靶)蛋白間的新的相互作用。先將體外表達的GST融合蛋白結合到谷胱甘肽Beads上,再將靶蛋白-GST-Beads和細胞裂解液孵育,這樣互作蛋白便一起吸附在Beads上。洗滌掉未結合的蛋白后,再用洗脫液將互作蛋白復合物從Beads洗脫下來,即GST pull down產物。這種互作復合物既可以用WesternBlot檢測已知蛋白,也可用質譜鑒定出未知蛋白。輝駿生物可制備GST融合蛋白,多種GST pull down蛋白互作方案供客戶選擇,100%保證GST融合蛋白沉降技術服務到成功發表文獻。


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    GST pull down實驗詳細步驟流程


    gst pulldown實驗詳細步驟_GST-pull down實驗技術服務外包_GST標簽蛋白.jpg

    圖:GST pull down實驗步驟流程





    應用領域



    GST pull down技術服務公司費用






    GST pulldown應用背景


    蛋白質是幾乎所有生命活動的直接效應分子,并且在行使功能的時候往往不是單打獨斗的,蛋白質之間經常形成復合體,并且在工作過程中還會不斷的更換相互作用的伙伴,從而行駛不同的功能。因此,研究蛋白質的相互作用成為研究蛋白質功能和作用機制的最為重要的環節之一。


    常見的蛋白相互作用方法主要有免疫共沉淀(Co-IP)、pull down、酵母雙雜交、熒光雙分子互補(BiFC)、熒光共定位等。


    pull down技術將目標蛋白進行體外原核表達,使標簽蛋白(GST或His等)與目標蛋白融合表達,借助標簽的親和介質將目標蛋白純化出來,可以不受抗體、物種限制,比較輕松的獲得目標蛋白的結合蛋白,還可以通過外源同時表達目標蛋白和待測蛋白,確定它們是否發生直接的相互作用,但該方法無法得知體內真實的結合情況。


    Co-IP技術采用目標蛋白的抗體捕獲樣本中的目標蛋白及其互作蛋白復合物,反應的是體內真實的生理結合,但是不能顯示這些相互作用是直接還是間接的;另外合適的免疫共沉淀抗體是決定實驗成功的關鍵,有些蛋白沒有可用的IP抗體,無法進行內源性Co-IP實驗;通過構建帶標簽的表達載體,使目標蛋白與標簽融合表達,借助標簽抗體可以完成Co-IP實驗,但需要注意合適的轉基因方法又是影響該方法成功的關鍵。


    酵母雙雜交技術是比較古老的一種技術,將目標蛋白和待測蛋白與GAL4 的兩個結構域BD和AD融合表達,在酵母細胞中,2個蛋白的結合使得BD和AD在空間上靠近,從而激活報告基因lacZ的表達。但是由于受試蛋白都需要和 AD/BD 結構域形成融合蛋白,空間構象可能改變;另外假陽性率也比較高。


    熒光雙分子互補(BiFC)技術將目標蛋白和待測蛋白分別與GFP的兩個片段融合表達,轉染細胞后,2個蛋白的結合使得GFP兩個片段空間上靠近,從而發出綠色熒光,該技術觀測直觀,操作簡便,但空間分辨率大約 250nm,對于蛋白質相互作用來說依然是個相當遠的距離,因此位置上靠近但并未結合的蛋白也可能顯示陽性結果,假陽性率較高;另外該技術可以驗證蛋白間的相互作用,但不能篩選未知互作蛋白。


    熒光共定位技術依靠熒光確定蛋白質具有相同定位,用于輔助證明而非直接證明細胞內蛋白間的相互作用。


    以上方法通常相互補充,多種方法共同確定蛋白質間的相互作用,也能更大程度的避免假陽性結果。





    GST pull-down技術實驗服務研究案例—客戶文章解析


    GST pull down實驗服務公司

    GYS2/p53負反饋環抑制HBV相關性肝細胞癌的腫瘤生長



    研究背景


    糖代謝異常是癌癥的突出特征,作者前期研究發現肝細胞癌(HCC)中的糖原含量降低,并與患者總體生存情況不良相關。探索HCC中的異常糖代謝機制或許可以為肝細胞癌的治療提供新的靶點。



    研究路線


    RNA-seq和qPCR等結果顯示HCC組織中的GYS2(糖原合成酶2)顯著下調,并與患者不良預后相關
    細胞和小鼠實驗表明GYS2的缺失促進了肝癌細胞增殖和腫瘤生長
    GYS2敲除細胞的RNA-seq實驗發現p53通路都受到明顯抑制
    Co-IP和 GST pull down證明GYS2通過與p53的直接相互作用發揮腫瘤抑制功能
    CO-IP和GST pull down實驗發現GYS2、p53和E3泛素連接酶MDM2相互作用形成復合體,GYS2與p53競爭結合MDM2來抑制p53泛素化,穩定p53蛋白水平
    熒光素酶和ChIP等實驗表明p53蛋白結臺GYS2啟動子,通過p300介導的乙?;?,在轉錄水平上抑制GYS2
    對HBV陽性肝中的關鍵致癌蛋白HBx的研究發現,HBx、HDAC1與乙?;膒53相互作用,共同抑制了GYS2




    研究結論

    本研究首次報道了HCC組織中糖原含量顯著降低,并與不利的患者預后相關,這歸因于新發現的HBx/GYS2/p53信號軸。低表達的GYS2促進HCC細胞增殖而非遷移,并提供了兩條獨立的證據線來支持GYS2和p53之間的關系。一方面,GYS2與MDM2競爭結合p53,以穩定p53免于蛋白酶體降解;另一方面,p53以負反饋方式抑制GYS2表達和糖原含量。這些數據表明p53和GYS2可能通過平衡彼此的表達而在HCC中發揮功能。


    gst-pull down實驗步驟及結果分析



    客戶文獻

    Chen S.L. et al:  A GYS2/p53 Negative Feedback Loop Restricts Tumor Growth in HBV-Related Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 2018. (IF=12.701).





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    輝駿實力

    輝駿GST pull down 實驗外包技術服務


    4899+客戶已添加微信獲取實驗優惠!


    輝駿生物提供的GST Pull down實驗技術服務分為以下兩種:


    1. GST Pull down WB,用于體外檢測誘餌蛋白與某樣本中的待測蛋白是否存在相互作用;

    2. GST Pull down MS,用于體外篩選誘餌蛋白與某樣本中的哪些蛋白具有相互作用。


    GST pull down檢測服務

    服務項目服務內容結果交付實驗周期  
    客戶提供價格
    GST pull down WB構建誘餌蛋白的GST原核表達載體(可選做)載體質粒、甘油菌、測序結果和實驗報告約2周        

    1、含有誘餌基因序列的質粒模板及測序文件

    2、實驗樣本

    3、待測蛋白抗體

    4、實驗信息表(樣本信息、誘餌蛋白和待測蛋白序列)

    點擊詢價



    原核表達誘餌蛋白并進行Western blot檢測Western blot檢測圖4-5周
    Western blot檢測待測樣本中的獵物蛋白Western blot檢測圖

    GST pull down捕獲誘餌蛋白及其互作蛋白

    (2組:實驗組、空載對照組)
    pull down實驗報告
    Western blot檢測Pull down產物中的誘餌蛋白和待測蛋白Western blot檢測圖
    GST pull down  MS       
    構建誘餌蛋白的GST原核表達載體(可選做)

    載體質粒、甘油菌、測序結果和實驗報告

    約2周      

    1、含有誘餌基因序列的質粒模板及測序文件

    2、實驗樣本

    3、實驗信息表(樣本信息、誘餌蛋白序列)

    點擊詢價

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    GST pull down捕獲誘餌蛋白及其互作蛋白

    (3組:實驗組、空載對照組、裂解液對照組)
    pull down實驗報告
    Western blot檢測pull down產物中的誘餌蛋白Western blot檢測圖
    LC-MS/MS定性檢測pull down產物的蛋白、篩選實驗組獨有蛋白(潛在互作蛋白)質譜檢索表格、互作蛋白篩選表格、檢測報告
    針對互作蛋白做生物信息學分析(GO、KEGG pathway、String)生物信息學分析結果和報告1周





    GST pull down技術服務優勢*輝駿生物

    1
    近十年服務經驗,眾多服務案例,服務成果得到優秀期刊認可
    2
    對蛋白互作的篩選鑒定理解深刻,擅長針對客戶情況提出合適的方案建議
    3
    自有分子及細胞生物實驗平臺,能有效制定并執行最優的實驗路線
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    自有蛋白質組學平臺,對微量互作蛋白的質譜鑒定有十足的把控能力,對后續的生物信息分析有獨到的見解
    5
    售后技術支持將一直保持到客戶發表文章,確??蛻舭残倪M行下游實驗及投稿






    GST pull down實驗服務樣本要求


    1. 送樣量要求


    樣本類型

    GST pull down WB建議送樣量

    GST pull down MS建議送樣量

    動物細胞3*10e7個細胞/組(約3個10cm皿)5*10e7個細胞/組(約5個10cm皿)
    動物組織1g/組2g/組
    植物葉片2g/組4g/組
    植物根或果實4g/組
    8g/組
    菌體50ul菌體沉淀/組100ul菌體沉淀/組


    ▲注意:這里列出的均為每組樣本的送樣量,如果實驗和對照組用的樣本一致,此樣本量*2。詳細送樣指南可聯系輝駿生物客服或銷售索取。

     


    2. 樣本保存和運輸要求:


    (1)樣本用PBS清洗干凈后,離心去掉液體,先放入液氮中速凍,再轉移至-80℃冰箱中保存;

    (2)樣本一定要做好標記,應用油性防凍記號筆或標簽紙在管上注明樣本名稱或編號;

    (3)樣本較多或需要分批做,要將樣本分裝;

    (4)干冰取樣/運輸;需要至少在送樣前一天通知我方。

     




    GST pull-down實驗結果示例


    GST pull down試驗服務結果分析

    gst pull down WB:Western blot檢測圖(陽性)


    GST-pull down外包實驗服務結果分析

    GST Pull-down MS:Western blot檢測圖


    GST pull down實驗服務費用價格實惠質量高

    GST pulldown MS:質譜檢索表格(部分展示)





    GST pull down實驗服務客戶文章


    1. Chen S.L. et al: A GYS2/p53 Negative Feedback Loop Restricts Tumor Growth in HBV-Related Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research.  2019,IF=9.727.
    【研究內容】:前期研究表明,GYS2基因在HCC患者低表達,干擾GYS2基因表達導致腫瘤增殖轉移。本研究通過融合表達GST-GYS2、His-p53、His-MDM2,并用GST-pull down方法,證實了MDM2與p53競爭性結合GYS2基因。相關的COIP、ChIP-qPCR等實驗進一步闡明GYS2基因降低腫瘤增殖轉移的機制。
    使用相關技術: gst pulldown測定、GST-pull down質譜分析、GST標簽蛋白


    2. Jiang L. et al: Bach1 Represses Wnt/β-Catenin Signaling and Angiogenesis. Circ Res. 2015,IF=14.467.
    【研究內容】:Wnt/β-catenin信號在內皮細胞的血管生成活性中起重要作用。過表達實驗表明,轉錄因子Bach1過表達可抑制后肢缺血小鼠的血管生成,并抑制Wnt3a刺激的血管生成反應和人臍靜脈內皮細胞Wnt/β-catenin靶基因的表達。Co-IP實驗和gst pull-down分析表明,Bach1直接與TCF4結合,并減少β-catenin與TCF4的相互作用。研究揭示了Bach1抑制外周缺血損傷后的血管生成的作用機制,為血管生成治療或其他涉及Wnt/β-catenin通路異常調節的疾病提供了新的治療靶點。
    使用相關技術: GST 融合蛋白、GST pull-down實驗、GST pull-down技術



    4899+客戶已添加微信獲取實驗優惠!


    GST pull-down試劑盒



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    GST pull-down試劑盒產品簡介


    輝駿生物的GST pull-down試劑盒能夠高效調取GST融合蛋白在各類樣本中的互作蛋白。在GST pull-down實驗前,先通過基因工程技術手段將目標基因和GST基因序列連接起來,并導入大腸桿菌中進行原核表達和純化,之后融合蛋白通過GST標簽與固相化在載體上的GTH( Glutathione)親和結合。接下來,當樣本中與融合蛋白有相互作用的蛋白通過層析柱時或與此固相復合物混合時就可被吸附而分離。



    GST pull down試劑盒組分


     試劑名稱 體積 保存條件
     GST標簽純化樹脂 1mL 4 ℃
     裂解緩沖液(PH 7.4) 40mL 4 ℃
     漂洗緩沖液(5×) 30mL 4 ℃
     洗脫緩沖液(PH 2.0) 1mL 4 ℃




    GST Pull down試劑盒產品優勢*輝駿生物


    1、GST融合蛋白與樹脂親和力強,可以高效純化目標蛋白及其互作蛋白;

    2、適用范圍廣,可用于動物組織、細胞、植物組織、微生物等各種類型的樣本;

    3、操作簡便,周期短。

    gst pulldown試劑盒-操作簡便-周期短-輝駿生物.png




    GST pulldown試劑盒使用流程簡述


    1. 通過原核表達系統表達帶有GST標簽的融合蛋白;

    2. 在細菌上清液中加入GST標簽親和純化樹脂,4 ℃孵育2 小時;

    3. 將待測樣本裂解液加入上述體系中,4 ℃孵育過夜;

    4. 漂洗、洗脫得到目標蛋白及其互作蛋白復合物。



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