免疫共沉淀CoIP實驗技術原理
細胞裂解后，孵育結合了抗體的珠子，誘餌蛋白通過其抗體結合到Beads上，同時誘餌蛋白的互作蛋白，也一起“共沉淀”到Beads上。洗滌掉未結合的蛋白后，再用洗脫液將互作蛋白復合物從Beads洗脫下來，便得到免疫共沉淀CoIP產物。CoIP產物既可用Western Blot檢測已知蛋白，也可用質譜鑒定未知蛋白。
當沒有合適的誘餌蛋白抗體時，可以通過表達融合了Flag標簽的誘餌蛋白，利用Flag標簽做免疫沉淀。即細胞過表達Flag-Bait，經裂解后與anti-Flag珠子孵育，誘餌融合蛋白與Beads結合，其互作蛋白“共沉淀”到Beads上，再經洗滌、洗脫后用WB或質譜檢測。
免疫共沉淀Co-IP實驗詳細步驟流程
內源蛋白抗體免疫共沉淀CoIP實驗步驟
標簽抗體免疫共沉淀CoIP實驗流程
應用領域
Co-IP（免疫共沉淀）實驗技術應用背景
蛋白質是幾乎所有生命活動的直接效應分子，并且在行使功能的時候往往不是單打獨斗的，蛋白質之間經常形成復合體，并且在工作過程中還會不斷的更換相互作用的伙伴，從而行駛不同的功能。因此，研究蛋白質的相互作用成為研究蛋白質功能和作用機制的最為重要的環節之一。
常見的蛋白相互作用方法主要有免疫共沉淀（Co-IP）、pull down、酵母雙雜交、熒光雙分子互補（BiFC）、熒光共定位等。
Co-IP技術采用目標蛋白的抗體捕獲樣本中的目標蛋白及其互作蛋白復合物，反應的是體內真實的生理結合，但是不能顯示這些相互作用是直接還是間接的；另外合適的免疫共沉淀抗體是決定實驗成功的關鍵，有些蛋白沒有可用的IP抗體，無法進行內源性Co-IP實驗；通過構建帶標簽的表達載體，使目標蛋白與標簽融合表達，借助標簽抗體可以完成Co-IP實驗，但需要注意合適的轉基因方法又是影響該方法成功的關鍵。
pull down技術將目標蛋白進行體外原核表達，使標簽蛋白（GST或His等）與目標蛋白融合表達，借助標簽的親和介質將目標蛋白純化出來，可以不受抗體、物種限制，比較輕松的獲得目標蛋白的結合蛋白，還可以通過外源同時表達目標蛋白和待測蛋白，確定它們是否發生直接的相互作用，但該方法無法得知體內真實的結合情況。
酵母雙雜交技術是比較古老的一種技術，將目標蛋白和待測蛋白與GAL4
的兩個結構域BD和AD融合表達，在酵母細胞中，2個蛋白的結合使得BD和AD在空間上靠近，從而激活報告基因lacZ的表達。但是由于受試蛋白都需要和
AD/BD 結構域形成融合蛋白，空間構象可能改變；另外假陽性率也比較高。
熒光雙分子互補（BiFC）技術將目標蛋白和待測蛋白分別與GFP的兩個片段融合表達，轉染細胞后，2個蛋白的結合使得GFP兩個片段空間上靠近，從而發出綠色熒光，該技術觀測直觀，操作簡便，但空間分辨率大約
250nm，對于蛋白質相互作用來說依然是個相當遠的距離，因此位置上靠近但并未結合的蛋白也可能顯示陽性結果，假陽性率較高；另外該技術可以驗證蛋白間的相互作用，但不能篩選未知互作蛋白。
熒光共定位技術依靠熒光確定蛋白質具有相同定位，用于輔助證明而非直接證明細胞內蛋白間的相互作用。
以上方法通常相互補充，多種方法共同確定蛋白質間的相互作用，也能更大程度的避免假陽性結果。
免疫共沉淀（Co-IP）技術服務案例—客戶文章解析
膽固醇通過APMAP抑制EGFR降解誘導前列腺癌細胞轉移
研究背景
轉移性前列腺癌具有很高的致命性。已有報道表明，膽固醇與前列腺癌的發展有關；前期研究發現，膽固醇可以誘導前列腺癌細胞發生上皮-間質轉化（EMT），但其作用及潛在機制尚不清楚。
研究線路
細胞功能實驗證實膽醇誘導前列腺癌細胞EMT的發生依賴于ERK1/2的激活RNA-seq、蛋白組學等實驗篩選和驗證與膽固醇有關的差異基因和蛋白，確定ERK1/2的上游凋節因子“ APMAI和“"EGFR”作為后續研究目標APMAP基因敵除后的RNA-seq結果及其細胞實驗均顯示APMAP和膽固醇可能有相似的功能APMAP和EGFR的表達關系實驗表明 APMAP通過調節EGFR參與膽固醇誘導的EMT過程免疫共沉淀Co-IP結合質譜實驗找到 APMAP的互作蛋白EPS15R免疫熒光結果顯示膽固醇誘導使EPS15R和APMAP的作用增強，EPS15R與EGFR解離,進而抑制EGFR降解
研究結論
本研究證明膽固醇介導APMAP上調，APMAP通過與EGFR競爭結合EPS15R，進而抑制EGFR降解，激活ERK1/2通路，促進前列腺癌細胞EMT；提出APMAP可能是一種關鍵的調節劑，為高脂肪飲食、肥胖和癌癥轉移之間提供了聯系。
客戶文獻
Jiang
S.Y. et al: Cholesterol Induces Epithelial-to-Mesenchymal Transition of
Prostate Cancer Cells by Suppressing Degradation of EGFR through APMAP. Cancer Research. 2019. (IF=12.701).
輝駿實力
實驗熱線：4006991663
