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    當前位置:首頁 > 科研服務 > 蛋白組/代謝組 > 蛋白定性 > LC-MS/MS修飾位點鑒定
    服務介紹應用案例常見問答

    通過液質聯用技術(LC-MS/MS)結合數據庫檢索,可以對目前已知的各種蛋白修飾類型(如磷酸化、乙?;?、甲基化、泛素化、琥珀?;龋┖鸵恍┬》肿铀幬镌诘鞍咨系男揎椢稽c進行鑒定。


     




    LC-MS/MS修飾位點鑒定-技術原理


    通過IP、親和純化或SDS-PAGE等方法分離純化得到目的蛋白,將目的蛋白進行酶解和液質聯用(LC-MS/MS)檢測,通過數據庫檢索得到設定好的修飾類型在目的蛋白上的修飾位點。


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    技術流程


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    lc-ms/ms修飾位點鑒定技術服務*輝駿生物優勢


    1
    不需要對修飾進行富集,可同時檢測多種修飾類型
    2
    項目周期短




    LC-MS/MS修飾位點鑒定-應用范圍


    1
    單一蛋白或低復雜程度蛋白樣本的修飾鑒定


    2
    已知分子量的小分子藥物與蛋白結合的修飾位點鑒定




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    中文標題:植物ESCRT組分FREE1穿梭到細胞核以減弱脫落酸信號

    發表期刊:Nature Plants

    影響因子:13.256

    合作單位:華南師范大學

    運用技術:IP-MS/MS磷酸化位點檢測(由輝駿生物提供技術支持)




    ● 研究背景


    內吞體分選轉運復合體(ESCRT)是真核生物中存在的保守的囊泡運輸調控機器,由20多個蛋白組成并分成ESCRT-0, -I, -II, -III以及VPS4/SKD1-LIP5等5個蛋白復合物,它們協同作用識別泛素化修飾的膜蛋白并將其分選到細胞內多泡體(MVB)的內小泡中,這樣當多泡體與液泡融合后,膜蛋白即被運輸至液泡內腔而被降解。已有研究表明,ESCRT蛋白參與了植物激素脫落酸(ABA)的信號轉導。作者團隊前期已經發掘了植物特有的ESCRT復合物組分FREE1,并解析了其調控膜蛋白轉運和自噬降解的功能,而有關ESCRT蛋白通過何組分以及哪種途徑參與植物激素脫r落酸(ABA)的信號轉導,仍有待進一步研究。

     



    ● 研究結果


    1.     通過使用新創建的free1-ctmut植物,發現FREE1的C-末端盤繞線圈結構域賦予ABA超敏反應


    在這項研究中,研究者利用CRISPR-Cas9技術繞過FREE1功能缺失的致死性,得到一個特異影響FREE1蛋白入核的突變體Free1-ctmut。Sanger測序結果顯示該突變體倒數第二個外顯子內有8bp的缺失(圖1A),這導致FREE1蛋白序列在581個氨基酸位點上有一個提前終止密碼子,引入了558-581個氨基酸殘基的外源多肽(圖1B)。WB分析檢測到Free1-ctmut植物中較小的內源FREE1,表明產生了截短的FREE1蛋白,并缺失了羧基末端的尾巴(圖1C)。Free1-ctmut突變體在正常生長條件下沒有表現出明顯的表型,但與野生型(WT)植株相比,對ABA介導的抑制成苗和ABA誘導的離體葉片衰老表現出更高的敏感性。

     

    FREE1蛋白有三個已知的結構域,包括氨基末端的固有無序區、FYVE結構域和C-末端卷曲圈區。為了深入了解FREE1蛋白不同結構域在介導Free1-ctmut植株脫落酸(ABA)敏感性中的作用,本研究將4個不同版本的綠色熒光蛋白分別與FREE1、Free1-ctmut、FREE1(?FYVE)和FREE1(?CC)融合到Free1-ctmut中,并對其進行了表型分析。如圖1D-F所示,全長FREE1完全補充了Free1-ctmut的ABA敏感表型,而C-末端截短的Free1-ctmut和FREE1(?CC)未能補充Free1-ctmut的表型,突出了FREE1 C末端在賦予Free1-ctmut植物的ABA超敏感表型中的功能重要性。先前的研究發現,FREE1的N端部分負責其與ABA受體的相互作用,而這個新建立的Free1-ctmut植物中,缺失部分位于C端卷曲區域(圖1),理論上不影響FREE1與ABA受體的相互作用。因此,Free1-ctmut的ABA超敏反應不太可能是由MVB介導的空泡分選缺陷和ABA受體的降解引起的。研究者通過雜交實驗進一步驗證猜想,并得出結論:Free1-ctmut作為ESCRT組分正常發揮作用,FREE1通過C末端負性調節ABA反應,其機制不同于先前報道的FREE1調節ABA受體內體分選的功能。

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    圖1



    2. ABA促進FREE1核輸入,核定位的FREE1補充FREE1-ctmut對ABA的超敏反應


    接下來,研究者使用先前建立的GFP-FREE1/FREE1互補系觀察了FREE1亞細胞定位模式對ABA的響應。有趣的是,ABA處理導致在共聚焦顯微鏡下觀察到的細胞核中GFP-FREE1的水平顯著增加,并在免疫印跡分析中檢測到。(圖2A,B)。此外,WT植株細胞核中內源FREE1水平的增加對ABA的響應進一步支持了ABA促進FREE1核進入的結論(圖2C)。此外,在GFP-FREE1-CTmut/Free1-ctmut系(圖2D)中,細胞核中GFP-FREE1-CTmut的水平沒有明顯增加。此外,FREE1抗體的WB分析進一步證實,內源FREE1-CTmut蛋白未能對ABA做出反應而移位到細胞核(圖2E)。這些結果表明,FREE1可能通過其在細胞核內的作用發揮其對ABA信號的抑制作用,而FREE1的C末端對于其穿梭到細胞核和植物對ABA的響應是必不可少的。為了提高FREE1在細胞核中的表達水平,研究者建立了GFP-FREE1-NLS/FREE1-ctmut和GFP-FREE1-NES(Mut)/FREE1-ctmut轉基因株系。GFP-FREE1-NLS顯示顯性的細胞核定位,而GFP-FREE1-NES(Mut)在沒有ABA處理的情況下核定位明顯增加(圖2F)。進一步的表型分析表明,GFP-FREE1-NLS和GFP-FREE1-NES(Mut)都能夠補充FREE1-ctmut對ABA的超敏表型(圖2G,H)。綜上所述,ABA處理促進了FREE1的核積累,但不促進FREE1-CTmut的核積累,次外,FREE1的核積累能夠補充FREE1-ctmut對ABA的敏感表型。


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    圖2



    3. ABA促進FREE1磷酸化,磷酸化的FREE1主要定位于細胞核


    大量研究表明,磷酸化修飾可調節蛋白質核質穿梭。為了驗證FREE1在用ABA處理時是否會發生磷酸化修飾,研究者檢測了有或沒有ABA處理的FREE1的磷酸化水平,結果顯示ABA處理顯著增加了FREE1的磷酸化水平(圖3A)。在GFP-FREE1CTmut/FREE1-CTmut系中檢測FREE1-CTmut的磷酸化水平,結果表明,FREE1-CTmut磷酸化水平的增加遠小于FREE1(圖3A),這表明ABA誘導的FREE1磷酸化需要C端。接下來,研究者在核和胞質組分中檢測有無ABA處理的FREE1磷酸化水平,結果表明,磷酸化的FREE1主要位于細胞核中(圖3B),表明FREE1可能需要進行磷酸化修飾才能在細胞核中積累。后續的時程和劑量反應實驗也進一步表明,ABA能夠誘導FREE1磷酸化,這需要FREE1的C末端;磷酸化的FREE1主要位于細胞核中。


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    圖3



    4. 依賴于SnRK2.2/2.3的FREE1磷酸化是ABA誘導的FREE1核輸入所必需的


    多研究表明,SnRK2分支蛋白激酶,包括SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6,是介導植物對ABA反應的關鍵正調控因子,ABA強烈激活ABA以進一步磷酸化下游因子。為了測試SnRK2激酶是否磷酸化FREE1對ABA的響應,研究者通過雙分子熒光互補(BIFC)等分析證實了FREE1與SnRK2.2/2.3在擬南芥葉片原生質體的細胞核和胞漿中的相互作用(圖3C)。Co-IP結果表明,ABA處理增強了FREE1與SnRK2.2和SnRK2.3之間的聯系(圖3D)。接下來,研究者利用幾個含有結構域截斷的FREE1突變體,用于與SnRK2的相互作用分析。結果表明,FREE1的C-末端卷曲區負責與SnRK2.2和SnRK2.3的相互作用。

     

    接下來,研究者進行了體外磷酸化實驗,以測試SnRK2激酶是否直接磷酸化FREE1。將純化的His-SUMO-FREE1分別與ABA處理的轉基因植物GFP-SnRK2蛋白和大腸桿菌His-MBP-SnRK2蛋白孵育。在這兩種情況下,His-SUMO-FREE1的磷酸化都很容易檢測到(圖3E)。此外,體內外實驗結果表明,SnRK2.2和SnRK2.3是ABA誘導FREE1磷酸化的預期激酶蛋白。為了進一步揭示ABA誘導和SnRK2S依賴的FREE1磷酸化是否與ABA誘導的FREE1核導入有關,研究者將GFP-FREE1導入現有SnRK2.2/2.3/2.6三重突變體的葉片原生質體中,在ABA處理后的SnRK2.2/2.3/2.6原生質體中沒有觀察到明顯的FREE1核導入增加(圖3F)。這一觀察結果得到證據的支持,即在ABA處理后,SnRK2.2/2.3/2.6三重突變體細胞核中內源性FREE1的水平沒有明顯增加(圖3G)。綜上所述,這些結果表明,依賴于SnRK2.2和SnRK2.3的FREE1磷酸化對于ABA誘導的FREE1核進口是必要的。



    5. ABA誘導的FREE1核進口需要絲氨酸殘基S530/S533的磷酸化


    為了確定相應的FREE1磷酸化殘基對ABA的響應,研究者對免疫沉淀的GFP-FREE1和GFP-Free1-ctmut蛋白進行了質譜分析。結果顯示,在GFP-Free1-ctmut蛋白中檢測到的兩個磷酸化位點S530和S533位于FREE1 C-末端卷曲圈區,而GFP-FREE1-CTmut蛋白中檢測不到。Free1-ctmut蛋白的缺失可能破壞了盤繞區域的結構,從而降低了S530和S533的磷酸化。因此,我們將目前的研究重點放在S530和S533在誘導ABA反應中的功能特性上。

     

    為了進一步驗證S530和S533的磷酸化是否參與了ABA誘導的FREE1核輸入,我們將YFP-FREE1(S530A/S533A)和YFP-FREE1(S530D/S533D)這兩個絲氨酸位點突變為非磷酸化的丙氨酸或磷酸化的天冬氨酸殘基,引入到FREE1突變株中,進行FREE1定位觀察和植物表型分析。對ABA處理和未處理的植株不同蛋白質組分的共聚焦觀察和免疫印跡分析均未發現YFP-FREE1(S530A/S533A)在細胞核內明顯積聚(圖4B,C)。相反,YFP-FREE1(S530D/S533D)在沒有ABA處理的補充植株中表現出明顯的核積累(圖4D,E)。此外,與免疫沉淀-質譜結果一致,ABA處理的轉基因植株和體外磷酸化實驗中純化的His-SUMO-FREE1(S530A/S533A)的YFPFREE1(S530A/S533A)的磷酸化水平都明顯降低(圖3E、4F)。YFP-FREE1(S530A/S533A)/Free1-ctmut表現出與Free1-ctmut相似的ABA過敏性,而YFP-FREE1(S530D/S533D)/Free1-ctmut在成苗和ABA誘導的葉片衰老方面與WT相似(圖4G,H),進一步支持S530/S533的磷酸化是必需的。


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    圖4



    6. FREE1通過抑制ABF4和ABI5的DNA結合能力來抑制ABF4和ABI5的轉錄活性


    為了研究FREE1在細胞核中的功能對ABA的響應,研究者以FREE1(231-601)的C末端部分為誘餌,在擬南芥互補DNA文庫中進行了酵母雙雜交篩選,在陽性克隆鑒定了編碼轉錄激活因子ABF4和ABI5的克隆,用于進一步的蛋白質相互作用分析。酵母雙雜交結果顯示,ABF4和ABI5都與FREE1(231-601)相互作用(圖5A),BIFC分析進一步證實了這種相互作用(圖5B)。在酵母雙雜交試驗中進一步的精細定位表明,Free1-ctmut(231-581)失去了與ABF4和ABI5的相互作用,而缺失了N末端的FREE1(421-601)仍然可以與這些轉錄因子相互作用。這些結果表明,FREE1的C端螺旋結構域專門負責與ABF4和ABI5的DNA結合域的相互作用(圖5A)。免疫共沉淀試驗表明,在沒有ABA的情況下,FREE1與ABF4或ABI5之間的相互作用很弱,但在ABA處理后得到加強(圖5C,D)。這些結果表明,FREE1C-末端殘基的磷酸化在調節ABA反應中起著重要作用。

     

    為了確定FREE1是否影響ABF4和ABI5在植物細胞中的轉錄激活活性,研究者在擬南芥原生質體中進行了雙熒光素酶的報告實驗。結果表明,在ABF4或ABI5單獨存在的情況下,ABA顯著誘導PAO1或EM6的表達,當與GFP-FREE1共表達時,這種誘導被顯著抑制,但與GFP對照(圖5E,F)不同,這表明FREE1直接抑制ABF4和ABI5對ABA的轉錄激活活性。接下來,為了檢測FREE1是否通過競爭性結合ABF4和ABI5轉錄因子的DNA結合域來抑制這兩種轉錄因子的轉錄激活活性,研究者通過電泳遷移率改變分析(EMSA)研究了FREE1對這兩種轉錄因子與下游基因順式調控序列結合活性的影響。結果表明,FREE1,而不是GFP對照,以劑量依賴的方式抑制ABF4和ABI5的DNA結合能力(圖5G,H),說明了FREE1對ABF4和ABI5轉錄激活活性的直接抑制作用。利用ChIP-qPCR方法進一步檢測Free1-ctmut突變是否會導致GFP-ABF4和GFP-ABI5對其靶基因啟動子序列的富集作用增強,并以GFP為陰性對照。結果表明,FREE1確實減弱了ABF4和ABI5對下游靶基因啟動子區域的DNA結合能力(圖5I,J)。


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    圖5



    7. ABF4或ABI5的缺失挽救了在Free1-ctmut突變體中產生的ABA超敏表型


    Free1-ctmut突變體對ABA的超敏表型很可能主要是由于ABF4和ABI5在細胞核內過度激活而沒有FREE1抑制所致。為了證實這種可能性,研究者測試了ABF4或ABI5的缺失是否會通過使Free1-ctmut與ABF4或ABI5突變體雜交來挽救在Free1-ctmut突變體中觀察到的ABA超敏表型。與預期一致,Free1-ctmut的ABF4或ABI5突變在成苗和ABA誘導的葉片衰老方面都表現出WT ABA反應(圖6A,B),即Free1-ctmut的ABA敏感表型可能是由ABF4和ABI5轉錄活性的過度激活引起的。此外,接下來,研究者檢測了ABA反應基因NYE1、NYC1、PAO1、RD29A、RD29B、NYE2和SAG29在WT、Free1-ctmut突變體ABF4、ABI5、Free1-ctmut/ABF4和Free1-ctmut/ABI5中的相對表達水平。結果顯示,所有檢測到的基因在未經ABA處理的Free1-ctmut突變體中的表達均升高,而在ABA處理下,表達誘導的升高更為顯著。然而,ABF4或ABI5突變消除了Free1-ctmut中ABA反應基因的這種表達誘導(圖6C,D)??傊?,這些結果表明,在Free1-ctmut中ABA反應基因的表達上調是由于ABF4和ABI5轉錄活性的過度激活所致。

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    圖6



    ● 結論


    研究在轉錄水平上證明了細胞膜轉運和ABA信號之間的串擾,并強調了植物ESCRT亞基FREE1的兼職特性,它除了在細胞質中的膜轉運中發揮作用外,還在細胞核中進化了獨特的非內體功能。


    Q1:蛋白質譜鑒定不成功一般有哪些因素?

    A:質譜鑒定不成功主要可以分為兩類,一類是質譜效果不好,一類是沒有可參考的蛋白數據庫,質譜效果不好的原因又可以細分為蛋白點太淡以至于蛋白含量過低(常見銀染的點)、蛋白酶解及質譜操作失誤等,要避免這些因素要盡量取顏色深一些的蛋白點,并且取的蛋白點面積需要適當大一些。


    Q2:做蛋白鑒定檢索時為什么同一個編號對應了很多蛋白質?

    A:因為一個蛋白家族中常常含有多個同源性很高的蛋白質,這些蛋白質被酶切之后,很可能會產生很多相同的肽段,軟件在進行定性分析時,就會將這些肽段均歸于得分高的那種蛋白質,其他同源蛋白不計分,并且這些同源蛋白都采用同一編號。


    Q3:怎么判定哪些蛋白是和自己研究相關的蛋白,挑選什么樣的蛋白進行后期實驗驗證?

    A:需要研究人員根據自己研究的相關生物學背景,再結合生物信息學分析的結果,以及查看相關的文獻資料來確認哪些蛋白可以用于后續深入的研究。后期的蛋白驗證實驗,一般情況下是根據客戶的需要,結合課題本身,在所篩選到的差異的蛋白中,找到自己關注的蛋白。并且在挑選的時候盡量挑蛋白可信度高的、差異變化較明顯的蛋白。目前驗證實驗的成功率比較低,一般情況下能有50%的概率已經是非常好的結果。


    Q4:蛋白質鑒定結果較少的可能原因是什么?

    A:●根據樣品SDS-PAGE圖(注:SDS-PAGE無過度染色情況),判斷樣本本身的蛋白質豐富程度,蛋白質條帶較少或者較淺(含量低)都會導致鑒定結果不佳,可考慮增加樣本量再進行檢測。

    ●根據SDS-PAGE圖判斷樣品中是否存在高豐度蛋白質,高豐度蛋白質會影響樣本整體蛋白質鑒定數量。

    ●有些物種的數據庫質量不好,包含的蛋白數目過少,這種可以考慮換大一級的物種分類數據庫,或者選擇在進化樹上同源性較近的、研究比較清楚的、基因組數據庫相對完整的模式物種的數據庫重新查庫。

    ●樣本中有污染或干擾物質,例如常見的有PEG、各種表面活性劑(如SDS、CHAPS、Triton、Tweens、NP-40等),一般在質譜的表現為規律的分子量間隔約44的峰。

    ●輝駿生物會根據TIC、basepeak圖等,判斷酶解、儀器狀態等是否正常,如果是儀器問題導致的鑒定結果不好,我方會即刻告知客戶并安排重復實驗。


    Q5:LC-MS/MS實驗能否提供蛋白質定量信息或確定樣品中不同蛋白質的相對含量?

    A:我們通常說的質譜鑒定(LC-MS/MS實驗)為定性實驗,不能做定量分析,但如果您要比較某樣本中不同蛋白質的相對含量,可參考蛋白質質譜鑒定結果中的emPAI值(據譜圖數、肽段數或肽段得分等來獲得的近似定量信息)來大概評估每個蛋白的豐度情況,但這只是粗略估計。

    如果您要比較蛋白在多組樣本間的相對表達差異,請選擇蛋白組組學的方法檢測,如label free,iTRAQ,TMT或DIA等,并且通常需要設置樣本重復,以便進行統計學分析。


    Q6:為什么質譜檢測到的蛋白質只是部分氨基酸序列,這樣的數據是否可信?

    A:質譜鑒定需要先進行蛋白質的酶解,酶解后的肽段再進行質譜分析。蛋白質酶解成肽段的回收率不能達到100%,一定會發生肽段的損失;如果是膠內酶解肽段的回收率會更低一些。

    由于蛋白質多種修飾形式的存在,會導致部分序列酶解不完全;或者由于蛋白質的序列特點(酶切位點過于稀疏或者密集),導致酶切后的肽段過小或者過大,都不利于質譜檢測。

     根據質譜檢測原理,肽段需要被離子化后才能被檢測到。由于肽段序列特點,導致某些不容易被離子化的片段很難被檢測到。

    因此,質譜法鑒定蛋白質的結果一般都只是鑒定到蛋白質的部分序列,即可以達到定性蛋白質的目的。


    Q7:質譜結果鑒定到很多蛋白,如何評估蛋白的可信度,或者如果篩選蛋白進行后續研究?

    A:輝駿生物提供的鑒定表格中包括了原始蛋白列表和過濾后的蛋白列表,其中過濾后的蛋白列表中為篩選(pep_expect<0.05)后的蛋白,均為可信蛋白。所有蛋白按照得分排序,得分越高的蛋白可信度越高。但要注意,如果您做的是IP,pull down類實驗,有意義的蛋白可能由于本身豐度較低而得分低、排名靠后,針對這種情況我們建議您主要依據蛋白功能判斷,其次參考得分。


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