背景：
骨關節炎(OA)是一種衰老或創傷相關的退行性關節疾病，其確切發病機制仍不明確。目前尚無有效的疾病治療方法，迫切需要開發新的治療藥物。因此，了解控制軟骨細胞肥大和調控細胞外基質降解相關基因表達的機制對于開發有效的OA治療方法具有重要意義。

內容概述：
2018年3月，輝駿生物合作伙伴，南方醫科大學第三附屬醫院骨科器官衰竭研究國家重點實驗室在期刊Ann Rheum dis上發表了題為“Tyrosine kinase Fyn promotes osteoarthritis by activating the β-catenin pathway”的文章，深入探究了酪氨酸激酶Fyn在小鼠骨關節炎(OA)發生發展中的作用及其機制。結果表明，Fyn在人OA軟骨、老年小鼠軟骨和創傷后OA軟骨中的表達均明顯上調。Fyn聚集在關節軟骨細胞中，與β-catenin的第142位酪氨酸（Tyr142）直接作用并使其磷酸化，穩定β-catenin，促進其核轉位。Fyn基因的缺失有效延緩了小鼠創傷和年齡相關的OA發展。Fyn抑制劑AZD0530和PP1通過阻斷β-catenin途徑和降低關節軟骨中細胞外基質分解代謝酶的水平而延緩OA的進展。靶向Fyn或成為治療OA的一種新方法。

主要技術：
iTRAQ、CoIP MS、western blot，qPCR，基因過表達/干擾等；
輝駿生物為本研究提供了iTRAQ蛋白質組學檢測和分析服務。

研究路線：

 
研究結果：

1. Fyn在老年小鼠、創傷后OA小鼠和人類OA患者的關節軟骨中積累
研究者首先采用iTRAQ蛋白質組學技術研究了年輕(2個月)和老年(12個月)小鼠關節軟骨中的差異蛋白質，發現酪氨酸激酶Fyn在老年軟骨強烈上調 (圖1A)。通過Western blotting和免疫熒光實驗也證實了這一結果 (圖1B，C)，確定了Fyn的積累伴隨著老年小鼠軟骨的退化和OARSI分級的增加(圖1C，D)。之后又檢測了Fyn在手術誘導的創傷后骨關節炎小鼠模型中的表達，發現骨關節炎小鼠中Fyn水平隨著軟骨損傷的增加而顯著增加。在老年OA患者關節軟骨中，Fyn水平明顯較高，同時軟骨結構發生變性和丟失(圖1E，F)。這些結果表明，Src激酶家族成員Fyn在老年小鼠的退化關節軟骨和OA患者的損傷關節軟骨中高水平表達。
 

2. Fyn基因缺失阻止小鼠創傷后和衰老相關OA的發生    
為了確定Fyn在退化或受損軟骨細胞中積累的生物學意義，研究者進行了小鼠Fyn基因敲除實驗(圖2A，B)。與對照組相比，基因敲除組（Fyn-KO）小鼠關節軟骨或生長板的形態和組織均沒有明顯差異，這表明Fyn基因的缺失沒有引起小鼠骨骼發育異常。與對照組相比，Fyn-KO組小鼠的軟骨中蛋白質含量顯著減少，TUNEL染色顯示Fyn-KO小鼠關節軟骨細胞凋亡明顯減少(圖2G)，軟骨降解程度有所降低。這些結果表明，Fyn的缺失有效地阻止了小鼠創傷后OA和年齡依賴性OA的發展。

 

3. Fyn結合軟骨細胞中的β-catenin、磷酸化Tyr142并使其穩定
為了探討Fyn促進OA發展的機制，研究者采用CoIP-MS方法篩選軟骨前體細胞系ATDC5中的Fyn結合蛋白，發現β-catenin可能是Fyn的潛在互作蛋白(圖3A)。CoIP實驗證實了兩者在ATDC5細胞(圖3B)、原代軟骨細胞和軟骨組織中存在相互作用。免疫熒光結果也顯示β-catenin與Fyn在ATDC5細胞中共定位(圖3C)。對軟骨細胞的體外Fyn激酶檢測發現Fyn可使β-catenin發生Tyr142磷酸化，且該作用可被Fyn激酶抑制劑PP1或AZD0530所抑制（圖3D）。此外，當Fyn被siRNA干擾后，β-catenin及其Tyr142磷酸化顯著下調，當Fyn過表達時則相反 (圖3E,F)。為了驗證Fyn在β-catenin信號通路中的作用，作者在ATDC5細胞中檢測了E-cadherin-catenin復合體的形成，發現Fyn被抑制時可以穩定鈣粘連蛋白-連環蛋白復合體，而Fyn過表達則破壞了該復合體(圖3H)。這些數據表明，Fyn結合β-catenin、磷酸化Tyr142并使其穩定，導致軟骨細胞中E-cadherin-catenin復合體解離。

 
4. Fyn激活β-catenin通路促進OA的發生
Fyn和β-catenin的免疫熒光結果顯示，隨著Fyn水平的增加，β-catenin從細胞膜轉移到了細胞核(圖4A)。用白介素1β(IL-1β)處理ATDC5細胞，發現其劑量依賴性地誘導Fyn和β-catenin在細胞漿和細胞核中積聚(圖4B)，并上調Fyn蛋白及其磷酸化水平(Tyr416)、β-catenin蛋白及其磷酸化水平(Tyr142)，以及MMP13蛋白水平(圖4C)。接下來，研究者評估了老年小鼠和創傷后OA小鼠軟骨中β-catenin蛋白及其磷酸化水平。結果顯示，β-catenin及其磷酸化水平隨著年齡的增長和OA的加重而增加(圖4D)。此外，創傷后Fyn敲除小鼠關節軟骨細胞中的β-catenin水平及其核定位明顯低于對照組(圖4F)。WNT3a是典型的Wnt/β-catenin途徑的激活劑。Fyn敲除實驗顯示，在OA發展過程中，Fyn激活了不依賴Wnt信號的β-catenin通路，并增強了β-catenin在關節軟骨細胞中的核轉位。
作者接著研究了Fyn是否通過β-catenin通路促進骨關節炎的發展。關節注射ICG-001（一種β-catenin/TCF 介導的轉錄抑制劑）明顯減少了軟骨損傷，維持了關節軟骨中蛋白多糖的含量，并降低了OA發生過程中的關節炎分級，退化軟骨中MMP13和ADAMTS5的表達水平也相應降低。這些結果表明，β-catenin通路參與了Fyn刺激軟骨細胞MMP13和ADAMTS5的表達以及小鼠OA的發生與發展。
 

5. Fyn抑制劑AZD0530和PP1抑制β-catenin信號轉導并阻止小鼠骨性關節炎的發生
為了研究Fyn作為OA治療靶點的潛在用途，研究者采用Fyn化學抑制劑AZD0530和PP1處理小鼠并收集其關節，與對照小鼠相比，AZD0530和PP1處理顯著減少了軟骨破壞(圖5A)、OARSI分級(圖5B)和滑膜炎癥，MMP13、ADAMTS5和X膠原含量、TUNEL陽性軟骨細胞數和骨鈣素表達也顯著減少(圖5C，D)。這些結果表明，抑制Fyn激酶活性可以阻止小鼠創傷后OA的發生。Western blotting顯示AZD0530或PP1可阻斷IL-1β刺激引起的MMP13和ADAMTS5的上調，并抑制p-β-catenin(Tyr142)的增加（圖5E）。接下來，研究者檢測了用或不用AZD0530或PP1AZD0530或PP1治療的創傷后OA小鼠的軟骨樣本中p-β-catenin(Tyr142)的表達。結果顯示，AZD0530和PP1處理的小鼠，MMP13、p-FYN和p-β-catenin(Tyr142)的表達均明顯降低(圖5F)。此外，用AZD0530或PP1治療OA時，Fyn和β-catenin在軟骨細胞核中也不再結合 (圖5G)。這些結果表明，AZD0530和PP1通過抑制FYN誘導的磷酸化β-catenin的表達來預防OA的發生。

 
結論：
本研究首次證明了SFK家族成員Fyn在軟骨退化和骨關節炎發展中有重要作用：（1）發現Fyn在衰老小鼠、患有實驗性骨關節炎的小鼠和骨關節炎患者的關節軟骨中積累。（2）發現Fyn結合β-catenin，磷酸化Tyr142和并增強其核轉位，這一作用在調節基質降解酶的表達和骨關節炎的發展中起著重要作用。