標題：METTL14-mediated N6-methyladenosine modification of SOX4 mRNA inhibits tumor metastasis in colorectal cancer.

期刊：Molecular Cancer

影響因子：10.679

關鍵詞：METTL14，SOX4，H3K4me3，YTHDF2，結直腸癌

主要技術方法：轉錄組測序（RNA-seq），m6A RNA免疫沉淀測序（MeRIP-Seq），染色免疫共沉淀（ChIP-qPCR），RNA免疫共沉淀（RIP-qPCR），RNA穩定性實驗，熒光素酶報告基因實驗等。

      結直腸癌（CRC）的主要死亡原因是遠處轉移。甲基轉移酶樣蛋白14(METTL14)是一種主要的RNA N6-腺苷甲基轉移酶，通過調節RNA功能參與腫瘤發展。本研究旨在揭示METTL14在CRC中的生物學功能及其分子機制。

       2020年6月，南京市第一醫院綜合臨床研究中心的研究人員發現CRC中METTL14的表達下調且與總生存率差有關。KDM5C介導了METTL14啟動子區域的H3K4me3，抑制了METTL14的轉錄。體外和體內實驗表明METTL14抑制CRC細胞的遷移、侵襲和轉移。METTL14可介導SOX4的m6A修飾，抑制其表達，該過程依賴于YTHDF2通路。 METTL14可能通過SOX4介導的EMT過程和PI3K/Akt信號部分抑制CRC的惡性過程。

1.    METTL14在CRC中低表達并促進腫瘤轉移和發展
數據庫分析發現METTL14在CRC中表達下調，qRT-PCR和IHC對臨床樣本的進一步檢測表明，METTL14在CRC中顯著下調，且與淋巴結轉移、遠處轉移和TNM分期顯著相關，低水平的METTL14患者表現出更差的生存期，暗示METTL14可能是一個獨立的CRC預后指標。

2.    KDM5C介導的H3K4me3去甲基化抑制了METTL14的轉錄
通過對ENCODE中H3K4me3的CHIP-Seq數據查詢發現，CRC細胞中H3K4me3在啟動子區域的富集明顯低于正常結直腸組織，KDM5C mRNA在CRC組織中顯著上調，且與METTL14的水平呈負相關（已知KDM5C可催化H3K4me2/3去甲基化，抑制基因轉錄）。實驗證明，KDM5C水平下降時，METTL14的RNA和蛋白水平均顯著升高。KDM5C和H3K4me3的ChIP-qPCR結果均顯示METTL14啟動子區被顯著富集，當干擾KDM5C后，可以明顯增加METTL14啟動子區的H3K4me3信號；因此推測KDM5C介導的H3K4me3去甲基化可能是引起METTL14表達下降的原因。

3.    METTL14抑制CRC細胞遷移和侵襲
對CRC細胞的qPCR檢測再次確認了METTL14在CRC細胞中的低表達。細胞transwell和CRC細胞移植小鼠實驗表明，METTL14高表達時，細胞遷移、侵襲及腫瘤轉移力下降，METTL14低表達時結果相反。

4.    SOX4是METTL14的下游靶標
通過對sh-METTL14細胞的RNA-seq及MeRIP-seq檢測，找到了在2組數據中重疊的25個轉錄本，并從中發現了已知的癌基因SOX4。RNA-seq結果顯示，當METTL14敲低時，SOX4顯著上調。MeRIP-seq結果顯示，SOX4 mRNA的終止密碼子附近檢測到m6A峰，其在METTL14干擾時全部降低，暗示SOX4可能是METTL14介導的m6A修飾的下游靶標。數據庫信息和qPCR/IHC實驗證據均表明METTL14的表達與SOX4的表達呈負相關。

5.    METTL14通過m6A-YTHDF2依賴性途徑抑制癌基因SOX4
MeRIP-qPCR確認了metl14過表達或干擾能顯著增加或降低SOX4的m6A豐度。SOX4野生和突變（無法進行m6A修飾）載體的熒光素酶實驗顯示，METTL14干擾只增加了SOX4野生型的轉錄水平，而不影響突變型，說明SOX4水平受METTL14相關m6A修飾的調控。qPCR檢測確認了穩定干擾METTL14能顯著促進SOX4的前體和成熟體的RNA水平。用放線菌素D處理sh-METTL14細胞及對照細胞以阻斷轉錄，結果顯示SOX4前體和成熟mRNA在對照細胞中的半衰期明顯短于在sh-METTL14細胞中的半衰期，表明m6A的修飾可能觸發了SOX4前體的剪接和成熟體的降解。

據報道，YTHDF1/2/3作為m6A閱讀器家族。YTHDF1/2/3的shRNA干擾實驗發現，只有干擾YTHDF2時顯著增加了SOX4的表達。YTHDF2抗體的RNA免疫共沉淀（RIP-qPCR）實驗證實了SOX4是YTHDF2的靶標。以上結果表明，METTL14介導的m6A修飾通過依賴于YTHDF2的mRNA降解抑制了SOX4的表達。

6.    METTL14通過SOX4介導的EMT過程和PI3K/Akt信號抑制結直腸癌的惡性過程
過表達/干擾實驗研究了SOX4在CRC中的致癌作用，transwell遷移和侵襲實驗顯示，SOX4干擾抑制了CRC的遷移和侵襲。接著細胞和小鼠實驗探討了METTL14和SOX4的關系，在METTL14過表達條件下再過表達SOX4時，SOX4過表達部分恢復了被METTL14上調抑制的細胞/腫瘤轉移能力。

據報道，SOX4控制TGF-β誘導的上皮-間質轉化(EMT)。本研究發現METTL14缺失促進EMT，而SOX4沉默可以逆轉該促進作用，說明METTL14通過抑制SOX4介導的EMT過程影響細胞遷移和侵襲。

另據報道，SOX4還是MAPK、PI3K-Akt和Wnt信號的重要激活劑。本研究發現METTL14敲除激活了PI3K/Akt信號通路，而SOX4沉默部分逆轉了該激活作用。LY294002是一種已知的PI3K化學抑制劑，可阻斷PI3K/Akt信號，LY294002處理后細胞的p-Akt水平降低，細胞遷移和侵襲能力也大大降低，表明METTL14通過抑制SOX4介導的PI3K/Akt途徑發揮功能。

本研究發現了新的METTL14/SOX4信號軸，其闡明了其對結直腸癌轉移的影響，這將對進一步的結直腸癌研究和治療提供幫助。