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    實驗簡介買此服務

    circRNA pull down技術原理


    目前,circRNA pull down技術絕大部分是基于接口序列設計探針捕獲circRNA及其結合蛋白。由于受限于接口處序列特征,很多circRNA無法設計出理想的探針,最終導致實驗失敗。 我司開發了一種新型的circRNA pull down方法,通過構建circRNA過表達載體,使circRNA連上一段16nt的短RNA序列標簽(命名為F2),該標簽與其特異性配體具有很強的親和力,因此可利用該系統高效調取靶RNA序列及其結合蛋白。最終通過western blot或LC-MS/MS實驗檢測洗脫液中靶RNA的潛在結合蛋白,還可通過qPCR實驗檢測能夠結合靶circRNA的miRNA。


    憑借10多年的 RNA 研究經驗,輝駿生物已掌握先進的 circRNA pull-down 技術,幫助您識別 miRNA/RBP 和 circRNA 之間的相互作用。每個項目都是完全定制的,以滿足您的科學需求,我們經驗豐富的團隊可以為任何個人要求提供靈活的解決方案,以更快的周轉時間和更低的價格向客戶保證最可靠和最有效的研究服務。如果您對circRNA pull-down有任何實驗問題,請隨時與我們聯系!


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    circRNA pull-down技術實驗流程


    circRNA pull down技術實驗.bmp






    應用領域



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    circRNA pull down應用背景


    環狀RNA(circRNA)是單鏈共價閉合的RNA分子,廣泛存在于各物種中。據報道,circRNA可作為轉錄調控因子、microRNA海綿和蛋白翻譯模板發揮生物學功能,

    除此之外,circRNA還可以結合蛋白質來發揮作用,如:


    1
    與兩種蛋白均相互作用,促進或解離它們之間的相互作用。
    2

    與一種蛋白相互作用,促進或解離其與另一種蛋白的相互作用。

     3
    與一種蛋白(如轉錄因子或酶)相互作用,促進或抑制其與靶DNA序列的結合。
    4


    與一種蛋白(如調控mRNA剪接、穩定和翻譯的RNA結合蛋白)相互作用,促進或抑制其與其他RNA的結合。
    5
    與一種蛋白相互作用,影響它的胞內運輸和定位(如核質轉運等),進而影響該蛋白的功能。


    以上這些作用模式又不是相互獨立的,而是可能存在重疊。

    由于蛋白質是幾乎所有生命活動的直接效應分子,因此研究circRNA與蛋白的相互作用極大地拓展了我們對circRNA功能的認知。



     



    circRNA pull down研究案例-客戶文章解析


    circRNA pull down研究案例

    circRHOT1通過激活NR2F6促進肝細胞癌進程



    研究背景

    利用在線數據庫對肝細胞癌(HCC)組織和癌旁組織的circRNA表達水平分析顯示,circRHOT1是在HCC中上調很明顯的一種保守性的circRNA,因此作者以circRHOT1為對象研究了其在HCC中的作用機制。



    研究路線


    1
    2

    Northern印跡、qRT-PCR、原位雜交等實驗確認了circRHOT1在HCC組織中高表達

    體內和體外實驗證明circRHOT1促進HCC增殖、遷移和侵襲

    3
    4

    RNA-seq等技術分析了circRHOT1缺失后的差異表達基因,其中NR2F6下調最多

    CHIRP實驗發現circRHOT1富集在NR2F6啟動子轉錄起始位點

    5
    6

    ChIP-qPCR等實驗顯示敲除circRHOT1影響了NR2F6啟動子轉錄起始位點組蛋白修飾,且RNA聚合酶II不能再結合該啟動子,circRHOT1促進NR2F6轉錄

    cicrRNA pulldown結合質譜實驗發現TP60是circRHOT1的潛在結臺蛋白, cicrRNA pull down WB、 RIP-qPCR等實驗確定了這一結果

    7
    8

    ChIP和基因表達實驗表明circRHOT1對PIP60介導的NR2F6表達至關重要

    表達和功能檢測發現NR2F6在腫瘤組織中上調,且促進HCC增殖、遷移和侵襲,circRHOT1通過激活NR2F6促進HCC進程




    研究結論

    circRHOT1通過募集TIP60蛋白到NR2F6啟動子來促進其表達,進而促進HCC進程。circRHOT1和NR2F6是HCC預后的潛在生物標志物,但由于在HCC患者中抑制circRHOT1較為困難,因此藥理學上抑制NR2F6可能更有希望。



    客戶文獻

    Wang L.Y. Circular RNA circRHOT1 promotes hepatocellular carcinoma progression by initiation of NR2F6 expression. Molecular Cancer. 2019. (IF= 27.401).







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    輝駿實力

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    輝駿生物提供的circRNA pull down服務分為以下兩種:


    1. circRNA pulldown WB,用于檢測某細胞中的目標circRNA與待測蛋白是否存在相互作用;

    2. circRNA pulldown MS,用于篩選某細胞中的目標circRNA與哪些蛋白具有相互作用。


    circRNA Pull down檢測服務
    服務項目服務內容結果交付實驗周期客戶提價格
    circRNA pull-down WBcircRNA-F2載體構建和成環檢測載體質粒、甘油菌、測序結果、qPCR檢測數據、實驗報告4周

    1、實驗樣本

    2、含有circRNA序列的質粒模板及測序文件

    3、待測蛋白抗體

    4、實驗信息表(樣本信息、抗體信息、circRNA和待測蛋白序列)




    點擊詢價



    培養目的細胞、circRNA-F2質粒轉染,檢測表達效率qPCR檢測數據3-4周

    circRNA pull down調取目標circRNA及其結合蛋白

    (2組:實驗組、空載對照組)
    circRNA pull down實驗報告
    5-6周
    qPCR評估pull down產物中的circRNA含量qPCR檢測數據
    circRNA pull-down MSWestern blot檢測Pull down產物中的待測蛋白
    Western blot檢測圖4周

    1、實驗樣本

    2、含有circRNA序列的質粒模板及測序文件

    3、實驗信息表(樣本信息、circRNA序列)










    點擊詢價




    circRNA-F2載體構建和成環檢測載體質粒、甘油菌、測序結果、qPCR檢測數據、實驗報告3-4周
    培養目的細胞、circRNA-F2質粒轉染,檢測表達效率
    qPCR檢測數據7-8周

    circRNA pull down調取目標circRNA及其結合蛋白

    (2組:實驗組、空載對照組)
    circRNA pull down實驗報告
    qPCR評估pull down產物中的circRNA含量qPCR檢測數據
    SDS-PAGE評估pull down產物中的蛋白含量和數量SDS-PAGE銀染檢測圖
    LC-MS/MS定性檢測pull down產物的蛋白、篩選實驗組獨有蛋白(潛在互作蛋白)質譜檢索表格、互作蛋白篩選表格、檢測報告
    針對互作蛋白做生物信息學分析(GO、KEGG pathway、String)生物信息學分析結果和報告
    1周


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    18927549347



    circRNA pull-down服務優勢*輝駿生物

    1. 該F2親和純化系統為輝駿生物自主研發,F2標簽與其特異性配體具有非常高的親和力,保證了該系統能夠高效調取circRNA及其結合蛋白,并且捕獲特異性更強。

    2. 由于F2標簽是跨接口設計,只有當形成circRNA時才能保證F2標簽的完整性,因此可以有效去除線性基因的背景干擾。

    3. 不受限于circRNA接口處序列,適用范圍更廣。

    4. circRNA pull down結合質譜的方法能夠高通量的篩選與靶circRNA結合的蛋白。




    circRNA pull down樣本要求


    1. 送樣量要求

    樣本類型
    circRNA pull down建議送樣量
    動物細胞5*10e7個細胞/組(約5個10cm皿)


    ▲注意:這里列出的均為每組樣本的送樣量,如果實驗和對照組用的樣本一致,此樣本量*2。詳細送樣指南可聯系輝駿生物客服或銷售索取。



    2. 樣本保存和運輸要求:

    (1)樣本用PBS清洗干凈后,離心去掉液體,先放入液氮中速凍,再轉移至-80℃冰箱中保存;

    (2)樣本一定要做好標記,應用油性防凍記號筆或標簽紙在管上注明樣本名稱或編號;

    (3)樣本較多或需要分批做,要將樣本分裝;

    (4)干冰取樣/運輸;需要至少在送樣前一天通知我方。



     

    circRNA pull down結果示例


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    circRNA成環檢測(qPCR)


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    circRNA調取效率檢測(qPCR)



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