RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation, RNA結合蛋白免疫沉淀）是研究體內 RNA 與蛋白結合情況的技術，主要包括RIP-qPCR和RIP-seq兩種；其中RIP-qPCR用來驗證與目標蛋白結合的已知RNA，RIP-seq用來篩選與目標蛋白結合的未知RNA。
RNA免疫沉淀RIP實驗原理
細胞裂解后，孵育結合了抗體的珠子，誘餌蛋白通過其抗體結合到Beads上，同時和誘餌蛋白互作的RNA，也一起沉淀到Beads上。洗滌掉未結合的RNA后，再用洗脫液將RNA-蛋白復合物從Beads洗脫下來，便得到RNA免疫沉淀產物。RIP產物既可用qPCR檢測已知RNA，也可以二代測序檢測未知RNA。
當沒有合適的誘餌蛋白抗體時，可以通過表達融合了flag標簽的誘餌蛋白，利用flag標簽做免疫沉淀。即細胞過表達Flag-Bait，經裂解后與anti-Flag珠子孵育，誘餌融合蛋白與Beads結合，與誘餌融合蛋白互作的RNA“共沉淀”到Beads上，再經洗滌、洗脫后做qPCR或NGS測序。
RNA免疫沉淀RIP實驗流程
帶標簽的RNA免疫共沉淀流程圖：
應用領域
RIP技術應用背景
RNA結合蛋白（RNA binding protein，RBP）是一類功能強大而廣泛的調節因子，約占細胞編碼的所有蛋白的5%~10%。目前除了少數RNA以核酶形式單獨發揮功能，大部分RNA通過與蛋白結合形成RNA-蛋白復合物來發揮作用。
一方面，RBP參與RNA合成、可變剪接、修飾、轉運、翻譯及胞內定位等多個轉錄后調控過程，調控mRNA穩定性、lncRNA活性、miRNA沉默復合體形成等生物學過程；另一方面，RNA也會調節這些蛋白質的活性、定位或與其他蛋白質的相互作用，從而影響RBP介導的各種細胞事件。RNA與蛋白質的相互作用對于維持細胞穩態是非常重要的，干擾這種相互作用將會導致細胞功能失調和相關疾病的發生。
目前研究RNA-蛋白質相互作用的方法分為兩大類：一是以感興趣的RNA為中心，尋找與該RNA結合的蛋白質；二是以感興趣的蛋白質為中心，尋找與該蛋白質結合的RNA。RIP（RNA免疫共沉淀）屬于后者，利用特異性的抗體捕獲樣本中的目標蛋白，那么與目標蛋白結合的RNA也一并被捕獲，之后通過qPCR或者測序技術來確定這些結合的RNA。
RNA免疫共沉淀RIP實驗—客戶案例
lncRNA PART1通過PLZF介導的EZH2募集導致PDGFB表觀遺傳沉默來抑制侵襲性胃癌
研究背景
目前的研究顯示，一種長鏈非編碼RNA(LncRNA)“PART1”在某些癌癥中有抑癌作用，在某些癌癥中又有致癌作用。人類胃癌組織的GEO芯片數據顯示，lncRNA PART1在胃癌中顯著下調，TCGA數據庫和GEPIA數據庫信息顯示低水平的lncRNA PART1更容易導致腫瘤轉移和患者生存期縮短；但其臨床意義和潛在機制尚未明確。
研究路線
細胞、CAM和小鼠實驗均表明PART1水平與胃癌的惡性程度、轉移能力呈負相關RNA-seq實驗發現高表達的PART1下調了PI3K-Akt通路的一些基因，上調了腫瘤抑制基因PLZF，腫瘤組織檢測和TCGA數據庫資料確定了該結果RNA pulldown結合質譜鑒走技術首次發現了PART1的潛在結合蛋白——AR(已有研究表明AR可以激活前列腺瘟中的PLZF并抑制其增殖ChIP和雙熒光素酶實驗表明AR與PLZF啟動子的2個位點結合，PLZF啟動子因AR、PART1的單獨作用或兩者的協同作用而激活數據庫調查和Co-IP結果均顯示PIZF蛋白與EZH2蛋白結合ChIP-qPCR結果表明PI3K-Akt通路蛋白PDGFB的啟動子與PIZF、EZH2蛋白結合、且該區域發生H3K27me3修飾功能回復實驗表明， PDGFB過表達可以部分回復PART1對GC細胞生長、遷移和侵襲、等能力的抑制
研究結論
lncRNA PART1是胃癌的腫瘤抑制因子，可以作為GC轉移和預后的預測因子。新發現的PART1作用機制是：PART1與AR相互作用，以雄激素非依賴性的模式激活腫瘤抑制因子PLZF，之后PLZF蛋白和EZH2蛋白相互作用，導致PI3K-Akt通路基因PDGFB的啟動子發生H3K27me3修飾，從而使促癌基因PDGFB的轉錄活性受到抑制。
客戶文獻
Han H. et al: Long noncoding RNA PART1 restrains aggressive gastric cancer through the epigenetic silencing of PDGFB via the PLZF-mediated recruitment of EZH2. Oncogene. 2020. (IF=9.867)
輝駿實力
實驗熱線：4006991663
