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    當前位置:首頁 > 科研服務 > 蛋白/核酸相互作用 > RNA-蛋白互作 > RIP(RNA結合蛋白免疫沉淀)
    實驗簡介買此服務

    RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation, RNA結合蛋白免疫沉淀)是研究體內 RNA 與蛋白結合情況的技術,主要包括RIP-qPCR和RIP-seq兩種;其中RIP-qPCR用來驗證與目標蛋白結合的已知RNA,RIP-seq用來篩選與目標蛋白結合的未知RNA。


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    RNA免疫沉淀RIP實驗原理


    細胞裂解后,孵育結合了抗體的珠子,誘餌蛋白通過其抗體結合到Beads上,同時和誘餌蛋白互作的RNA,也一起沉淀到Beads上。洗滌掉未結合的RNA后,再用洗脫液將RNA-蛋白復合物從Beads洗脫下來,便得到RNA免疫沉淀產物。RIP產物既可用qPCR檢測已知RNA,也可以二代測序檢測未知RNA。


    當沒有合適的誘餌蛋白抗體時,可以通過表達融合了flag標簽的誘餌蛋白,利用flag標簽做免疫沉淀。即細胞過表達Flag-Bait,經裂解后與anti-Flag珠子孵育,誘餌融合蛋白與Beads結合,與誘餌融合蛋白互作的RNA“共沉淀”到Beads上,再經洗滌、洗脫后做qPCR或NGS測序。






    RNA免疫沉淀RIP實驗流程


    RIP實驗,RNA結合蛋白免疫共沉淀,RIP-seq檢測實驗.jpg

    帶標簽的RNA免疫共沉淀流程圖:

    RIP-qPCR,rip技術實驗,rip實驗外包.jpg





    應用領域



    coip技術服務.bmp






    RIP技術應用背景


    RNA結合蛋白(RNA binding protein,RBP)是一類功能強大而廣泛的調節因子,約占細胞編碼的所有蛋白的5%~10%。目前除了少數RNA以核酶形式單獨發揮功能,大部分RNA通過與蛋白結合形成RNA-蛋白復合物來發揮作用。


    一方面,RBP參與RNA合成、可變剪接、修飾、轉運、翻譯及胞內定位等多個轉錄后調控過程,調控mRNA穩定性、lncRNA活性、miRNA沉默復合體形成等生物學過程;另一方面,RNA也會調節這些蛋白質的活性、定位或與其他蛋白質的相互作用,從而影響RBP介導的各種細胞事件。RNA與蛋白質的相互作用對于維持細胞穩態是非常重要的,干擾這種相互作用將會導致細胞功能失調和相關疾病的發生。


    目前研究RNA-蛋白質相互作用的方法分為兩大類:一是以感興趣的RNA為中心,尋找與該RNA結合的蛋白質;二是以感興趣的蛋白質為中心,尋找與該蛋白質結合的RNA。RIP(RNA免疫共沉淀)屬于后者,利用特異性的抗體捕獲樣本中的目標蛋白,那么與目標蛋白結合的RNA也一并被捕獲,之后通過qPCR或者測序技術來確定這些結合的RNA。

     





    RNA免疫共沉淀RIP實驗—客戶案例

    RIP(RNA免疫共沉淀)研究案例.png

    lncRNA PART1通過PLZF介導的EZH2募集導致PDGFB表觀遺傳沉默來抑制侵襲性胃癌



    研究背景


    目前的研究顯示,一種長鏈非編碼RNA(LncRNA)“PART1”在某些癌癥中有抑癌作用,在某些癌癥中又有致癌作用。人類胃癌組織的GEO芯片數據顯示,lncRNA PART1在胃癌中顯著下調,TCGA數據庫和GEPIA數據庫信息顯示低水平的lncRNA PART1更容易導致腫瘤轉移和患者生存期縮短;但其臨床意義和潛在機制尚未明確。



    研究路線


    細胞、CAM和小鼠實驗均表明PART1水平與胃癌的惡性程度、轉移能力呈負相關
    RNA-seq實驗發現高表達的PART1下調了PI3K-Akt通路的一些基因,上調了腫瘤抑制基因PLZF,腫瘤組織檢測和TCGA數據庫資料確定了該結果
    RNA pulldown結合質譜鑒走技術首次發現了PART1的潛在結合蛋白——AR(已有研究表明AR可以激活前列腺瘟中的PLZF并抑制其增殖
    RNA pull down WBRIP qPCR實驗確定了PART1與AR的相互作用
    ChIP雙熒光素酶實驗表明AR與PLZF啟動子的2個位點結合,PLZF啟動子因AR、PART1的單獨作用或兩者的協同作用而激活
    數據庫調查和Co-IP結果均顯示PIZF蛋白與EZH2蛋白結合
    ChIP-qPCR結果表明PI3K-Akt通路蛋白PDGFB的啟動子與PIZF、EZH2蛋白結合、且該區域發生H3K27me3修飾

    功能回復實驗表明, PDGFB過表達可以部分回復PART1對GC細胞生長、遷移和侵襲、等能力的抑制




    研究結論

    lncRNA PART1是胃癌的腫瘤抑制因子,可以作為GC轉移和預后的預測因子。新發現的PART1作用機制是:PART1與AR相互作用,以雄激素非依賴性的模式激活腫瘤抑制因子PLZF,之后PLZF蛋白和EZH2蛋白相互作用,導致PI3K-Akt通路基因PDGFB的啟動子發生H3K27me3修飾,從而使促癌基因PDGFB的轉錄活性受到抑制。




    客戶文獻

    Han H. et al: Long noncoding RNA PART1 restrains aggressive gastric cancer through the epigenetic silencing of PDGFB via the PLZF-mediated recruitment of EZH2. Oncogene. 2020. (IF=9.867)





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    輝駿實力

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    4899+客戶已添加微信獲取實驗優惠!

    輝駿生物提供的RIP(RNA免疫共沉淀)服務分為以下兩種


    1. RIP-qPCR,用于檢測某樣本中的誘餌蛋白和待測RNA是否結合;

    2. RIP-seq,用于篩選某樣本中的誘餌蛋白可以結合哪些RNA。


    RIP(RNA免疫共沉淀)檢測服務
    服務項目
    服務內容結果交付實驗周期客戶提價格
    RIP qPCRWestern blot檢測樣本(input)中的誘餌蛋白Western blot檢測圖5-6周

    實驗樣本

    誘餌蛋白的IP級抗體

    實驗信息表(樣本信息,誘餌蛋白及待測RNA序列)



    點擊詢價




    RIP調取誘餌蛋白及其結合的RNA

    (2組:實驗組和對照組)
    RIP實驗報告
    Western blot檢測RIP產物中的誘餌蛋白Western blot檢測圖
    qPCR檢測RIP產物中的待測RNAqPCR檢測數據
    RIP seqWestern blot檢測樣本(input)中的誘餌蛋白Western blot檢測圖5-6周

    實驗樣本

    誘餌蛋白的IP級抗體

    實驗信息表(樣本信息,誘餌蛋白序列)



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    RIP調取誘餌蛋白及其結合的RNA

    (2組:實驗組和對照組)
    RIP實驗報告
    Western blot檢測RIP產物中的誘餌蛋白
    Western blot檢測圖
    seq檢測ChIP產物中的RNA并分析seq檢測結果、檢測和分析報告9周


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    RIP(RNA免疫共沉淀)服務優勢*輝駿生物


    1

    十年服務經驗,眾多服務案例,服務成果得到優秀期刊認可

    2

    可對圍繞RNA結合蛋白開展的整體課題提供全方位方案建議。

    3

    自有分子及細胞生物實驗平臺,能有效制定并執行最優的實驗路線

    4

    自有蛋白質組學平臺,對微量互作蛋白的質譜鑒定有十足的把控能力,對后續的生物信息分析有獨到的見解




    RIP(RNA免疫共沉淀)樣本要求


    1. 送樣量要求


    樣本類型
    樣本類型RIP seq建議送樣量
    動物細胞
    3*10e7個細胞/組(約3個10cm皿)5*10e7個細胞/組(約5個10cm皿)
    動物組織1g/組1g/組

    ▲注意:這里列出的均為每組樣本的送樣量,如果實驗和對照組用的樣本一致,此樣本量*2。詳細送樣指南可聯系輝駿生物客服或銷售索取。



    2. 樣本保存和運輸要求:

    (1)樣本用PBS清洗干凈后,離心去掉液體,先放入液氮中速凍,再轉移至-80℃冰箱中保存;

    (2)樣本一定要做好標記,應用油性防凍記號筆或標簽紙在管上注明樣本名稱或編號;

    (3)樣本較多或需要分批做,要將樣本分裝;

    (4)干冰取樣/運輸;需要至少在送樣前一天通知我方。

     



    RNA免疫共沉淀RIP結果示例


    圖片.png

    rip qPCR檢測數據


    圖片.png

    RIP組相對于input組的富集圖(% input)


    圖片.png

    RIP組相對于IgG組的富集圖





    RIP技術實驗客戶文章


    1. Bao X.C. et al: Capturing the interactome of newly transcribed RNA.Nature Methods,15(3): 213–220. 2018,IF=28.467.
    【研究內容】:輝駿生物為作者單位之一,和作者共同開發了一種捕獲鑒定新生RNA結合蛋白的全新方法(RICK)。該方法用EU標記新生RNA,通過點擊反應-生物素-鏈霉親和素系統結合質譜分析,分離鑒定RNA互作蛋白。其中,METTL1和CDK1是兩個RICK獨有的RNA結合蛋白。 RIP-qPCR、RIP-Seq、CLIP-Seq等實驗進一步證實了它們與非PolyA RNA的結合,這種結合在細胞分化與增殖中發揮了重要作用。
    使用相關技術RIP-qPCR、RNA免疫共沉淀RIP-Seq、RNA結合蛋白免疫沉淀技術


    2. Bao. X.C. et al: The p53-induced lincRNA-p21 derails somatic cell reprogramming by sustaining H3K9me3 and CpG methylation at pluripotency gene promoters. Cell Research.2015, IF=13.9.

    【研究內容】:客戶利用RNA pull down、CoIP等技術,發現lincRNA-p21與HNRNPK結合,并和甲基化酶SETDB1、DNMT1形成復合物,作者通過RIP-qPCR進一步證實了細胞中存在該復合物。該復合物甲基化了多能性基因的啟動子序列及相應組蛋白,并改變了它們的表達量,從而進一步影響體細胞重編程過程。

    使用相關技術RIP seq、RNA結合蛋白疫共沉淀rip qpcr、質譜鑒定


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